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系統識別號 U0026-1002201113285600
論文名稱(中文) 探討sir-2.3基因在Cry5B毒殺線蟲時所扮演的角色
論文名稱(英文) Characterization of the sir-2.3 gene in response to Cry5B intoxication in Caenorhabditis elegans
校院名稱 成功大學
系所名稱(中) 生物化學暨分子生物學研究所
系所名稱(英) of Biochemistry and Molecular Biology
學年度 99
學期 1
出版年 100
研究生(中文) 陳奐達
研究生(英文) Huan-Da Chen
學號 s1697101
學位類別 碩士
語文別 中文
論文頁數 73頁
口試委員 指導教授-陳昌熙
口試委員-鄭宏祺
口試委員-洪瑞祥
中文關鍵字 結晶毒素 
英文關鍵字 Pore-Forming toxins(PFTs) 
學科別分類
中文摘要 結晶毒素[Crystal(Cry) toxins]是由革蘭氏陽性桿菌[Bacillus thuringiensis(Bt)]蘇利桿菌所產生的膜穿孔毒素[Pore-forming toxins (PFTs)]。膜穿孔毒素可在宿主細胞膜上形成孔洞進而使宿主細胞死亡,在許多人類病原菌當中,膜穿孔毒素是很重要的一種致病毒理因子。Cry毒素由於對昆蟲與線蟲類的特殊專一性,而被廣泛應用在生物防治上。在過去文獻已經指出Cry毒素的其中一員Cry5B,可以毒殺許多種類的線蟲,包含實驗室常用的模式生物線蟲(C. elegans) ,藉此我們進行Cry5B和線蟲之間的膜穿孔毒素—宿主交互作用之相關研究。
我們利用全基因體微晶片進行處理Cry5B後線蟲之基因轉錄體分析,發現其中sir-2.3基因的轉錄在處理Cry5B後有顯著的上調現象。SIR-2.3是需要菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的去乙醯酵素並且是SIR2家族的一員,在過去已有研究指出SIR-2.3的哺乳類同源物SIRT4,可以抑制胰臟細胞胰島素的分泌。在本研究中我們發現SIR-2.3與類胰島素受器DAF-2在線蟲抵抗Cry5B的毒殺當中都扮演了很重要的角色,我們另外也去探討SIR-2.3與DAF-2兩者之間的關係。
英文摘要 Pore-Forming toxins(PFTs) are bacterial toxins that form holes at the plasma membrane of cells and play important roles in the pathogenesis of many important human pathogens. Crystal(Cry) toxin is one type of the PFTs produced by Bacillus thuringiensis(Bt), and is also the most widely used natural insecticides in agriculture for many decades. It has been reported that C. elegans and other nematodes can be intoxicated and killed by the three-domain Bt Cry toxins, including Cry5B in this study.
Characterizations of the mode of action of Cry5B in C. elegans may pave the way for understanding the PFT-host interactions in vivo.
From our previous microarray data, we found significant transcriptional upregulation of the sir-2.3 gene after Cry5B treatment in
C. elegans. SIR-2.3 is a member of the SIR2 family proteins with a NAD-dependent histone deacetylase activity. We have demonstrated that DAF-2 insulin-like signaling pathway was important for the intrinsic
cellular defense against PFTs. Interestingly, it has been reported that the mammalian SIR-2.3 homolog, SIRT4, can also inhibit the insulin secretion in pancreatic  cells. Our current data suggested that sir-2.3 and daf-2 all function in Cry5B intoxication, and we also analyzed the
interaction between these two genes.
論文目次 中文摘要…………………………………………………….……………I
英文摘要…………………………………………………………………II
目錄………………………………………………………………………1
緒論………………………………………………………………………5
假說………………………………………………………………………9
材料與方法…………………………………………………………..…10
線蟲突變株的培養與維持……………………………………………..10
質體與基因轉殖株製備………………………………………………..11
質體製備………………………………………………………………..11
基因轉殖株製備………………………………………………………..12
線蟲同步化……………………………………………………………..13
Cry5B 表現系統……………………………………………...…………14
生命週期測試…………………………………………………..………15
毒性測試…………………………………………………………..……16
即時定量聚合酵素鏈鎖反應………………………………………..…18
單一蟲體聚合酵素鏈鎖反應…………………………………………..19
影像呈現……………………………………………………………..…20
藥品配方…………………………………………………………..……21
結果…………………………………………………………………..…23
sir-2.3 會因為Cry5B的處理而大量表現………………………………23
SIR-2.3 會參與在Cry5B毒殺線蟲的機制…………………..…………23
sir-2.3 的突變並不會造成線蟲生命週期的短縮……………...………24
sir-2.3 的突變與Cry5B防禦機制有專一性的現象……………………24
daf-2 在Cry5B 毒殺線蟲上扮演重要的角色…………………..………25
daf-2 與sir-2.3 有可能參與同一條路徑………………………..………25
藉由胰島素基因突變株來瞭解SIR-2.3 與DAF-2 的關係……………26
Cry5B 與DAF-16 入核的關係………………………………….………27
研究SIR-2.3 所作用的位置…………………………………….………28
於神經細胞表現SIR-2.3 無法改變線蟲對Cry5B 的敏感度………….29
討論…………………………………………………………......………30
sir-2.3 在Cry5B毒殺線蟲時扮演保護的角色…………………………30
類胰島素訊息傳遞路徑以及MAPK 訊息傳遞路徑皆會參與在Cry5B
的毒殺機制中…………………………………………………..………32
Cry5B的存在會刺激sir-2.3 在腸道大量表現…………………………33
結論與未來研究方向………………………………………………..…34
參考文獻………………………………………………………......……35
圖……………………………………………………………………..…37
圖一、Cry膜穿孔毒素蛋白作用機制…………………………………37
圖二、線蟲生命週期…………………………………………………....38
圖三、類胰島素訊息傳遞路徑…………………………………………39
圖四、SIRT4 可以在胰島細胞調控胰島素的分泌………...…………40
圖五、Invitrogen Gateway®系統介紹………………………………….41
圖六、unc-119 基因恢復檢測方式……………………………………...42
圖七、Cry5B 蛋白誘導………………………………………………….43
圖八、sir-2.3 基因型檢測……………………………………………….44
圖九、線蟲餵食Cry5B 後之sir-2.3 轉錄體分析……………………….45
圖十、sir-2.3 突變株進Cry5B液體毒性測試…………………………..46
圖十一、sir-2.3 突變株進Cry5B 培養皿毒性測試……………………47
圖十二、sir-2.3 突變株餵食Cry5B 後的外顯型態……………………48
圖十三、sir-2.3 突變株的生命週期測試……………………………….49
圖十四、sir-2.3 突變株進行其他壓力測試…………………………….50
圖十五、類胰島素訊息路徑突變株進行Cry5B液體毒性測試.......…..51
圖十六、sir-2.3 與daf-2 利用遺傳上位基因分析方式進行Cry5B 液體
毒性測試………………………………………………………………..52
圖十七、ins-11 以及daf-28 突變株的Cry5B 培養皿毒性測試….....…..53
圖十八、TJ356 在NG OP50 上25℃四小時……………………………55
圖十九、TJ356 在ENG-IC JM103 pQE9 上25℃四小時………………56
圖二十、TJ356 在ENG-IC JM103 pQE9-Cry5B 上25℃四小時.……...57
圖二十一、TJ356 在NG OP50 上30℃一小時…………………………58
圖二十二、TJ356 在ENG-IC JM103 pQE9 上30℃ 一小時…..............59
圖二十三、TJ356 在ENG-IC JM103 pQE9-Cry5B 上30℃一小時…....60
圖二十四、TJ356 在NG OP50 上25℃四小時後30℃一小時…………61
圖二十五、TJ356 在ENG-IC JM103 pQE9 上25℃四小時後30℃一小
時………………………………………………………………………..62
圖二十六、TJ356 在ENG-IC JM103 pQE9-Cry5B 上25℃四小時後30℃
一小時……………………………………………………………..……63
圖二十七、DAF-16 入核比率量化分析…………………..……………63
圖二十八、Psir-2.3::GFP 基因轉殖株餵食Cry5B 後螢光蛋白表現…..64
圖二十九、神經細胞專一表現SIR-2.3 基因轉殖株的Cry5B 培養皿毒
性測試………………………………………………………..…………66
圖三十、SIR-2.3 參與在Cry5B 毒殺線蟲的機制中並扮演保護角色...68
質體總覽………………………………………………………………..68
Ⅰ. sir-2.3 開讀框在pDONR-221載體內……………………...………69
Ⅱ. unc-31 3` 非轉譯區在pDONR-P2RP3 載體內……………………70
Ⅲ. unc-31 5` 非轉譯區在pDONR-P4R1P 載體內……………………71
Ⅳ. unc-31::sir-2.3::unc-31 在pCG150 載體內…………………...……72
Ⅴ. pQE9-Cry5B 質體…………………………………………….……73
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  • 同意授權校內瀏覽/列印電子全文服務,於2016-02-16起公開。
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