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系統識別號 U0026-0812200911182481
論文名稱(中文) 利用DNA晶片與反轉錄聚合鏈反應分析Hz-1病毒 急性與持續性感染之基因表現
論文名稱(英文) Global analysis of Hz-1 viral gene expression profiles during productive and persistent infections using a DNA microarray and RT-PCR
校院名稱 成功大學
系所名稱(中) 生物科技研究所碩博士班
系所名稱(英) Institute of Biotechnology
學年度 92
學期 2
出版年 93
研究生(中文) 羅文聰
研究生(英文) Wen-Tsung Lo
學號 L6690101
學位類別 碩士
語文別 中文
論文頁數 91頁
口試委員 指導教授-陳虹樺
口試委員-吳定峰
口試委員-李松泰
口試委員-吳梨華
口試委員-劉校生
中文關鍵字 生物晶片  Hz-1病毒 
英文關鍵字 microarray  Hz-1 virus 
學科別分類
中文摘要 長久以來人類一直與自然界中的病原體對抗,尤其是感染人類的病毒,許多與人類疾病相關的病毒能夠游走在急性和持續性感染之間,病毒一旦進入持續性感染後,便會潛藏在宿主中伺機而動,待宿主體內免疫系統降低,這些潛伏的病毒又會再次復發,往往患者會受到病毒反覆感染,造成醫療上的困擾,病人身心上的痛苦,因此,研究病毒持續性感染的機制是一項重要的課題。
Hz-1病毒是雙股DNA昆蟲病毒,基因組總長228 kb左右,是目前數種已完全定序完成的昆蟲病毒之一,其基因組中經預測大於50個胺基酸長度的開放讀架區(ORF)共有154個,另外,由過去的研究知道Hz-1病毒中有一段能轉錄成RNA而不產生蛋白的序列pag1存在,此段RNA是目前在Hz-1病毒進入持續感染期間唯一偵測到的病毒表現,Hz-1病毒是一個良好的模式病毒,一方面因為Hz-1病毒是昆蟲病毒,不會感染研究者;另一方面持續性感染的昆蟲細胞株已經存在,對於持續性感染機制的研究有很大的助益。因此,本篇論文便以Hz-1病毒為研究材料,藉著生物晶片技術的快速分析性與高精確性等優點,迅速分析Hz-1病毒基因間相互關係與在急性和持續性感染過程中的基因表現差異點,為了印證晶片分析結果,我們使用反轉錄聚合鏈反應。
為了達到實驗目標,首先我們建立了Hz-1病毒急性感染後0到24小時間基因表現圖譜(gene expression profiles),另外,病毒進入持續性感染期時的基因表現圖譜也同時完成。隨後,將急性與持續性感染的基因表現圖譜,分別利用GeneSpring 6.0套裝分析軟體分析數據,過去的研究告訴我們,一些功能相似的病毒基因會在相近的時間點表現且也具有相同或相似的表現趨勢,依據此結果我們使用gene tree分析工具將急性感染過程中表現趨勢不同的病毒基因進行分群可歸成六大類(A-F)。 A群為在感染後持續表現至8小時後下降,此組中共有4個均無註解,一般此種感染後立即表現的基因,常是一些調控因子以控制宿主細胞,創造適合病毒複製適當的環境;B群為感染後出現兩次表現高峰,第一次出現在4小時表現較低量,第二次出現在20小時表現較高,群中共有22個ORFs有三個註解,IAP是抑制宿主細胞進行細胞自戕,可能此群中有些是幫助病毒控制宿主的因子;C群共有27個,表現在4或8小時出現高峰,而在16-24小時間表現持續高昇,此群中包含protein kinase及p34等調控因子;D群表現也是出現雙坡峰的表現型態,跟B群不同的是第一次在4小時且表現量較微弱,第二次出現在20小時共有26個;E群的特點是出現持續性高量表現在8-20小時,共有55個,此群中有許多與DNA複製相關的基因表現,如Shymidylate synthase (TS), Ribonucleotide reductase 1 (RR1) and RR2,及複製過程中所需的代謝因子;最後F群大部分在12-24小時有高表現,包含VLF-1基因存在。基因樹狀圖的分析有助於我們更了解Hz-1病毒基因間相互的關聯性,可以提供未來近一步研究的資訊。再則,持續性感染的基因圖譜藉由GeneSpring 6.0的分析我們發現表現大於兩倍的ORFs共有33個,在這些基因中,有許多基因與宿主細胞有同源關係,如 Thymidylate synthase (TS), Matrix metalloproteinase, Deoxynucleoside kinase, Ribonucleotide reductase 2 (RR2) 及 dUTP Pyrophosphatase, 也許這些基因的表現可能與病毒建立持續性感染有關。


英文摘要 Many viruses can infect their hosts as both productive and persistent infections. Persistently infected viruses can be reactivated when the host surveillance is decreased. It is an important issue to study the mechanism of the viral persistence. Hz-1 virus is a good model virus for that it is an insect virus and cannot infect human being. In addition, Hz-1 virus can establish persistently infected cell lines. Thus, Hz-1 virus is a very useful model virus for the study of persistent infection.
This proposal was to study the kinetics of gene expressions of Hz-1 virus during productive and persistent infections and to study the possible functions of these genes. Therefore, biochip technology was applied to establish Hz-1 viral gene expression profile during productive and persistent infections. Genes with similar functions have the same expression patterns. Using cluster analysis, all productively expressed genes were classified into six groups according to their similar expression patterns. Comparing genes with known function to those with unknown functions, the possible functions of these unknown genes were assigned. In addition, all Hz-1 viral ORFs that expressed during the persistent infection could be divided into six groups. The expression profiles of the Hz-1 virus during its productive and persistent infections were confirmed with RT-PCR and northern blot analyses.


論文目次 目錄

中文摘要………………………………………………… I
英文摘要 …………………………………………………III
致謝 ………………………………………………………IV

第一章、前言 ……………………………………………1

第二章、文獻探討
I. 昆蟲桿狀病毒 (Baculovirus)
1. 昆蟲桿狀病毒的構造 ………………………………3
2. 昆蟲桿狀病毒的分類 ………………………………3
3. 昆蟲桿狀病毒的複製及感染週期 …………………4

II. Hz-1 病毒 (Hz-1 virus)
1. Hz-1病毒的發現 ……………………………………4
2. Hz-1病毒的構造 ……………………………………5
3. Hz-1病毒的複製及感染期 …………………………5
4. Hz-1病毒的分類地位 ………………………………6
5. Hz-1病毒在急性與持續性感染的過去研究結果 …6
6. 本實驗室關於Hz-1病毒研究成果 …………………7

III. 生物晶片技術 (Biochip technology)
1. 生物晶片技術的起源 ………………………………8
2. 生物晶片的種類與原理 ……………………………9
2-1 核酸晶片(DNA chip ) ……………………………9
2-2 蛋白質晶片(Protein chip) ……………………10
2-3 微流體晶片 (Microfluidic chip) ……………10
2-4 實驗室微縮晶片 (Lab-on-a-chip) ……………10
3. 生物晶片的應用現況 ………………………………11

第三章、實驗材料與方法
I. 實驗材料
1. 細胞株 ……………………………………………12
2. Hz-1病毒 (Hz-1 virus) ……………………… 12
3. 微點陣列載體 (Microarray supporter) …… 12
4. 微陣列點陣儀 (Microarrayer)及影像擷取掃描器 12
5. 分析軟體 …………………………………………13

II.實驗方法
1. Hz-1核酸晶片的產生
1-1 Hz-1病毒放大與效價測定 …………………… 13
1-2 Hz-1病毒總DNA萃取與南方墨點法 ……………14
1-3 Hz-1病毒專一性聚合鏈反應引子設計 ……… 15
1-4 Hz-1病毒聚合鏈反應與產物純化定量 ……… 16
1-5 Hz-1病毒核酸晶片點製 ……………………… 16
2. 螢光探針 (Fluorescent-probe) 之製備
2-1 Hz-1病毒感染與總RNA萃取 ……………………16
2-2 mRNA的純化與定量分析 ……………………… 17
2-3 反轉錄反應與螢光標定合成探針 …………… 18
3. Hz-1病毒核酸晶片雜合反應
3-1 核酸晶片的前處理 …………………………… 19
3-2 雜合作用 ……………………………………… 19
4. 雜合反應影像偵測與量化分析
4-1 Hz-1病毒基因表現分析 ……………………… 20
4-2 Hz-1病毒反轉錄聚合鏈反應分析 …………… 20

第四章、實驗結果
1.Hz-1病毒核酸晶片的產生
1-1 Hz-1病毒總DNA的萃取 ………………………… 22
1-2 聚合鏈反應引子設計 ……………………………22
1-3 聚合鏈反應與產物純化定量 ……………………23
1-4 核酸晶片的點製 …………………………………23

2.Hz-1病毒螢光探針的合成
2-1 Hz-1病毒總RNA的萃取 ………………………… 23
2-2 Hz-1病毒mRNA純化與定量分析 …………………24
2-3 反轉錄反應與螢光標定合成探針 ………………24
3.Hz-1病毒核酸晶片雜合反應的影像訊息 ………… 25
4.Hz-1病毒基因表現分析
a. Hz-1病毒在急性感染時期中基因表現圖譜
(Gene expression profiles of Hz-1 virus during productive infection )
a-1 Positive control與negative control ……… 26
a-2 DNA複製相關基因,核酸聚合脢(DNA polymerase)27
a-3 DNA 複製相關基因,Thymidlate synthase (TS) 27
a-4 調控相關基因,蛋白質活化激脢 (Protein kinase, PK) 28
a-5 末期基因調控因子 (VLF-1) ………………………28
a-6 結構相關基因,鞘蛋白(p95) …………………… 28
a-7 結構相關基因,外套膜蛋白基因(p74) ………… 29
a-8 基因樹狀圖(Gene Tree) ………………………… 29


b. Hz-1病毒在持續性感染過程中基因表現圖譜
(Gene expression profiles of Hz-1 virus during persistent infection)…31
5.反轉錄聚合鏈反應分析 ……………………………… 31

第五章、實驗討論
1. 核酸晶片的製備
1-1 Hz-1 病毒OFR片段的產生 ……………………… 32
1-2 玻璃載體 ………………………………………… 32
2. 雜合反應 ……………………………………………32
3. 晶片分析
3-1 晶片螢光訊息的偵測 …………………………… 33
3-2 數值分析 ………………………………………… 34
4. 反轉錄聚合鏈反應 …………………………………36

第六章、參考文獻 ………………………………………38

表目錄

表一、聚合鏈反應160對引子序列表 ……………………44
表二、Hz-1病毒在急性感染時ORFs關係樹狀圖分類表 49
表三、Hz-1病毒在持續性感染中有2倍以上表現量的ORF列表54
表四、反轉錄聚合鏈反應分析Hz-1病毒ORFs表現分類表 55

圖目錄

圖一、Hz-1病毒蛋白質激脢Southern blot ……………60
圖二、PCR products電泳圖 …………………………… 61
圖三、Hz-1病毒核酸晶片點製圖 ……………………… 62
圖四、total RNA電泳圖 …………………………………63
圖五、mRNA QC電泳圖…………………………………… 64
圖六、螢光探針QC電泳圖…………………………………65
圖七、晶片雜合反應影像圖………………………………66
圖八、Hz-1病毒整體基因表現折線圖……………………68
圖九、Positive and negative controls表現折線圖…69
圖十、核酸聚合脢(DNA polymerase )基因表現折線圖 70
圖十一、Thymidlate synthase (TS) 基因表現折線圖 71
圖十二、蛋白質活化激脢 (Protein kinase; PK) 基因表現折線圖72
圖十三、VLF-1基因表現折線圖………………………… 73
圖十四、鞘蛋白(p95) 基因表現折線圖…………………74
圖十五、外套膜蛋白基因(p74) 基因表現折線圖………75
圖十六、Hz-1病毒基因樹狀圖……………………………76
圖十七、Hz-1病毒持續性感染晶片分析圖………………77
圖十八、RT-PCR電泳圖……………………………………78
圖十九、核酸聚合脢 (DNA polymerase)RT-PCR分析電泳膠……… 79
圖二十、Thymidlate synthase (TS) RT-PCR電泳膠… 80

附圖目錄

附圖一、Hz-1病毒基因圓形圖譜…………………………81
附圖二、Hz-1病毒核酸聚合脢(DNA polymerase ) northern blot82
附圖三、Hz-1 病毒TS基因RT-PCR……………………… 83
附圖四、Hz-1病毒蛋白質活化激脢 (Protein kinase; PK)北方墨點法.84

參考文獻 王權輝,2003,Hz-1病毒DNA聚合脢基因表現模式、蛋白質純化與活化分析。國立成功大學生物科技研究所論文。

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