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系統識別號 U0026-0812200910415862
論文名稱(中文) Ku 蛋白質在急性白血病(AML 與ALL) 與慢性 骨髓系白血病其量之變化
論文名稱(英文) Ku Protein Expressed in Acute Leukemia (AML and ALL) and Chronic Myeloid Leukemia (CML)
校院名稱 成功大學
系所名稱(中) 分子醫學研究所
系所名稱(英) Institute of Molecular Medicine
學年度 91
學期 2
出版年 92
研究生(中文) 曾潤煜
研究生(英文) Ruen-Yu Tzeng
學號 t1689404
學位類別 碩士
語文別 中文
論文頁數 107頁
口試委員 指導教授-曹朝榮
指導教授-鄭瑞棠
口試委員-劉大智
中文關鍵字 慢性骨髓性白血病  庫蛋白  急性白血病 
英文關鍵字 Ku protein  acute leukemia  chronic myeloid leukemia 
學科別分類
中文摘要 當正常造血細胞發生細胞增生或形態不正常的情形,稱為血液惡性腫
瘤,血液性的惡性腫瘤包括有白血病,淋巴瘤,單株γ球蛋白病變等。Ku 是一異連二聚體的核蛋白質,最早在自體免疫病人血清發現,則被當作自體抗原。Ku 蛋白質分別是70 kDa (簡稱Ku70) 與80 kDa (或86kDa) (簡稱Ku 80/ 86) 所形成之異連二聚體,再與450 kDa 之催化單位(簡稱DNA- PKcs),形成DNA- dependent protein kinase (DNA- PK)。Ku蛋白質參與DNA 雙股修護,免疫球蛋白與T 細胞V(D)J 連接調控,核染色質結構之調節,染色體終端維持,細胞週期G2/M 調控等。Ku 蛋白質在細胞株與癌症有以下相關報導,約20% 之Ku 80 (-/-) p53 (+/-) 老鼠在40 週時產生各種癌症,全部Ku 80 (-/-) p53 (-/-) 老鼠在16 週時產生pro-B 細胞淋巴瘤。Ku-null 突變細胞株Ku 70 (-/-) 與Ku 80 (-/-) 與wild-type 細胞相比,其對抗癌藥物有高度敏感性。Ku 缺乏之細胞株比wild-type 細胞對bleomycin 引起之DNA fragmentation較為敏感,而Ku70 與Ku 80 過度表現之R-7080-6 細胞則對bleomycin 引起之細胞凋有抗性。p-glycoprotein 過度表現的細胞會一直活化DNA-PK 活性,用wortmannin 抑致DNA- PK 活性後,多藥劑耐性細胞對抗癌藥物,例
如:bleomycin 與vincristine 的敏感度就增加了。BCR-ABL 表現的血液細胞調降DNA-PKcs。本研究則是探討Ku protein 在急性白血病(AML與ALL) 與慢性骨髓系白血病,其量的變化及與疾病之相互關係,希望能對診斷及治療提供有利的資料。

在AML (N=19), ALL (N=16),BCR-ABL 陽性細胞株與ALL (N=2),慢性骨髓系白血病(芽細胞危象期) ,Ku 70 與Ku 80 蛋白質大量表現,但在BaF/p190,BaF/p210,慢性骨髓系白血病(慢性期或加速期,N=7),正常檢體(N=12),Ku 70 與Ku 80 蛋白質均低下。在急性白血病(AML 與ALL) 與慢性骨髓系白血病(芽細胞危象期) 之Ku 70 與Ku 80 表現均呈現顯著關聯性(p 值小於0.05)。由於Ku 蛋白質與其RNA 量在急性白Ku 蛋白質與p-gp 或早期標記(CD34,HLA-DR,CD7) 並無顯著關聯性。BCR-ABL 陽性K562 細胞經proteasome 抑制劑(lactacystin 或LLnl) 處理後,Ku 蛋白質表現不受影響。同時在BCR-ABL 陽性K562 細胞與慢性骨髓系白血病(芽細胞危象期或加速期),Ku 蛋白質與酪胺酸激? 或Ki-67 (增生指數) 亦無顯著關聯性。

本研究之結果顯示在AML, ALL,BCR-ABL 陽性慢性骨髓系白血病(芽
細胞危象期) ,Ku 70 與Ku 80 蛋白質大量表現,可提供臨床評估血液惡性腫瘤疾病病程與預後情形。未來對Ku protein 功能方面研究,更有助對Ku 的深入了解及疾病間相互調控與變化。
英文摘要 Where the hematopoietic cell in abnormal number or abnormality in the cell
morphology is means hematological malignancies. The hematological
malignancies include the leukemia, the lymphoma, and monoclonal gammo-
pathies. Ku is heterodimeric nuclear protein originally identified as an antigen
recognized by sera from patients with autoimmune disease. Ku is composed
of approximately 70-kDa and 80-kDa subunits (Ku 70 and Ku 80). Ku forms
a complex DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) by associating with
450-kDa catalytic subunit (DNA-PKcs). Ku is involved directly and indirectly
in many important cellular metabolic process such as DNA double-strand
break repair, V(D)J recombination of Ig and T-cell receptor gene, regulation
of the precise structure of telomeric termini, and play a novel role in G2 and
M phase of the cell cycle. About 20% of Ku 80 (-/-) p53 (+/-) mice develop-
ed a broad spectrum of cancer by 40 weeks and all Ku 80 (-/-) p53 (-/-) mice
developed pro-B-cell lymphoma by 16 weeks. Ku-null mutant cell lines Ku
70 (-/-) and Ku 80 (-/-) were highly sensitive to anticancer drugs, compared
with their wild-type cells. Ku-deficient cells were more sensitive to bleomy-
cin-induced DNA fragmentation than wild-type cells, where R-7080-6 cells
over-expressing both human Ku 70 and Ku 80 were resistant to bleomycin-
induced apoptosis. P-glycoprotein over-expression cells have consititutively
active DNA-PK activity, and inhibition of DNA-PK by wortmannin leads to
increase in sensitivity of MDR (multidrug resistance) cell against anticancer
drug (bleomycin and vincristine). BCR-ABL expression hematopoietic cells
can down-regulation DNA-PKcs. In this study we purposed to investigate Ku
protein expressed in acute leukemia (AML and ALL) and CML, and whether
coordinately in disease process. Furthermore, provide new prognostic infor-
mation and insights into future therapeutic strategies.
Ku 70 and Ku 80 protein were overexpressed in AML (N=19) , ALL (N=16)
and BCR-ABL (+) cell line, ALL (N=2) and CML in blast crisis (N=5) but
decreased in BaF/p190, BaF/p210, CML in chronic or accelerated phase (N=7)
and normal specimens (N=12). In acute leukemia (AML and ALL) patients,
Ku 70 showed a significant positive correlation with Ku 80 (p value below
0.05), and same to CML in BC. We suggested the Ku expression seemed to be
post-transcriptional, since RNA level of Ku didn’t correlate with its protein
level. We failed to see the association between Ku and p-gp or stem cell
markers (CD34, HLA-DR and CD7) in acute leukemia. No effect on Ku
expression was found in BCR-ABL (+) K562 cell after treatment with
proteasome inhibitors (lactacystin or LLnl). There was no association between
Ku protein and tyrosine kinase or Ki-67 (proliferative index) in BCR-ABL (+)
K562 cell or CML (BC or AP).
Our studied have indicated that Ku protein was overexpression in AML, ALL
and CML in BC suggested that might offer a insights and prognostic strategy
in hematological malignancies. The function assay in Ku protein remaining
further investigation.
論文目次 目錄(Index)
中文摘要… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … I
英文摘要… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … III
誌謝… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … V
目錄… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … VI
表/圖目錄… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .XI
第一章緒論(Introduction)… … … … … … … … … … … … … … … … . 1
(壹)、血液惡性腫瘤簡介… … … … … … … … … … … … … … … … … … 2
(貳)、DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) 簡介… … … … … . 2
(參)、Ku protein 簡介… … … … … … … … … … … … … … … … … … … . 3
(肆)、Ku protein 與DNA-PK protein 的結構模型… … … … … … 4
(伍)、Ku protein 的功能… … … … … … … … … … … … … … … … … 5
(陸)、Ku protein 在細胞株與癌症相關報導… … … … … … … … … 6
(一)、Ku 80-mutant mice and p53… … … … … … … … … … … … 6
(二)、Ku protein affect the susceptibility to anticancer drugs
and radio sensitivity… … … … … … … … … … … … … … … . 7
(三)、DNA-PK activitity in CLL leukemic cells… … … … … … .. 7
(四)、Ku80 in B-CLL leukemic cells … … … … … … … … … … .. 8
(五)、Ku 86v in multiple myeloma… … … … … … … … … … … .. 8
(六)、DNA-PK 與multidrug resistance (MDR)… … … … … … 8
multidrug resistance 簡介… … … … … … … … … … … … . 9
(七)、DNA-PKcs 與BCR-ABL… … … … … … … … … … … … . 10
(柒)、研究的目的… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 10
第二章檢體、材料與方法(Specimen、Materials and Methods)… 11
第一部份:檢體
(壹)、急性白血病病人… … … … … … … … … … … … … … … … … … … 14
(貳)、BCR-ABL (+) 病人… … … … … … … … … … … … … … … … … .. 14
(參)、對照組… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 14
第二部份:材料與方法
(壹)、細胞繼代培養… … … … … … … … … … … … … … … … … … … 14
(貳)、細胞冷凍保存… … … … … … … … … … … … … … … … … … … 16
(參)、單核細胞製備:… … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 17
(一)、周邊血液檢體… … … … … … … … … … … … … … … … … 18
(二)、骨髓檢體… … … … … … … … … … … … … … … … … … … 18
(肆)、流式細胞儀分析:… … … … … … … … … … … … … … … … … … 20
p-gp (MDR)、CD34、CD7、HLA-DR、Ki-67
(一)、未結合螢光之單株抗體染色法:Ki-67… … … … … … … 21
(二)、結合螢光之單株抗體染色法:p-gp (MDR)、CD34、CD7、
HLA-DR… … … … … … … … … … … … … … … … … … . 22
(伍)、細胞總蛋白質之抽取… … … … … … … … … … … … … … … … .. 23
(陸)、蛋白質定量與相關性… … … … … … … … … … … … … … … … .. 26
(一)、總蛋白質之測試… … … … … … … … … … … … … … … .. 26
(二)、以house keeping 蛋白質(β-actin) 將欲分析蛋白質
標準化… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 28
(柒)、聚丙烯醯胺膠體電泳:… … … … … … … … … … … … … … … … 29
β-Actin、Ku 70、Ku 80、DNA-PKcs
(捌)、西方墨點分析:… … … … … … … … … … … … … … … … … … … 33
β-Actin、Ku 70、Ku 80、DNA-PKcs
(玖)、去除墨點分析… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 37
(拾)、反轉錄-聚合? 連鎖反應:β-actin,Ku 70,Ku 80
(一)、RNA 抽取:Rezol 方法… … … … … … … … … … … … … 40
(二)、RNA 濃度計算法… … … … … … … … … … … … … … … … 42
(三)、反轉錄反應… … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 43
(四)、聚合? 連鎖反應:β-actin,Ku 70,Ku 80… … … … … . 45
(五)、電泳分析PCR 產物… … … … … … … … … … … … … … ... 48
第三部份:統計方法… … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 50
第三章結果(Results)… … … … … … … … … … … … … … … … … … … 51
第一部份:急性白血病
(壹)、Ku protein 在急性白血病病人之表現與關聯性… … … … … .. 52
(貳)、Ku 86v protein 在急性白血病病人之表現… … … … … … … … 53
(參)、Ku protein 與mRNA level 在急性白血病病人之表現… … .. 53
(肆)、Ku protein 與p-gp在急性白血病病人之表現與關聯性… … 54
(伍)、Ku protein 與stem cell marker (CD34、HLA-DR、CD7)
在急性白血病病人之表現與關聯性… … … … … … … … … … … ..55
第二部份:慢性骨髓性白血病
(陸)、Ku protein 在BCR-ABL (+) cell line,BCR-ABL (+) CML
與ALL 之表現… … … … … … … … … … … … … … … … … … … . 56
(柒)、Ku protein 在CML blast crisis,accelerated phase 或
chronic phase 之表現與關聯性… … … … … … … … … … … … .. 58
(捌)、BCR-ABL (+) K562 cell 經proteasome inhibitors (lactacystin
或LLnl) 處理,Ku protein 之表現… … … … … … … … … … … 59
(玖)、BCR-ABL (+) K562 cell,CML (BC 與AP) 病人經STI-571
處理,Ku protein 之表現… … … … … … … … … … … … … … . 60
(拾)、Ki-67 在CML 病人之表現… … … … … … … … … … … … … . 61
第四章討論(Discussion)… … … … … … … … … … … … … … … … … 62
(壹)、Ku protein 增加於AML,ALL 與BCR-ABL (+) cell line,
ALL 與CML blast crisis,低下於BaF3/p190,BaF3/p210 與
CML accelerated phase 或chronic phase… … … … … … … .. 63
(貳)、Ku 70 與Ku 80 在AML,ALL 與CML blast crisis 呈現
顯著關聯性… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 64
(參)、Ku protein 與mRNA level 之變化不一致,建議此變化是發
生在post-transcriptional… … … … … … … … … … … … … … … 64
(肆)、Ku protein 在急性白血病病人之表現與p-gp 或stem cell
marker (CD34、HLA-DR、CD7) 無顯著關聯性… … … … … .. 65
(伍)、BCR-ABL (+) K562 細胞Ku protein 之表現不受proteasome
inhibitors (lactacystin 或LLnl) 影響… … … … … … … … … . 65
(陸)、BCR-ABL (+) K562 細胞、CML 在BC 或AP 病人Ku
protein 量之上升與cell proliferative 無關係… … … … … … … 66
(柒)、BCR-ABL 對Ku protein 之表現無明顯影響… … … … … … 66
(捌)、Ku 86v 表現的意義… … … … … … … … … … … … … … … … .. 66
(玖)、結語與未來方向… … … … … … … … … … … … … … … … … … … 68
參考文獻(References)… … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 69
表/圖(Tables/Figures)… … … … … … … … … … … … … … … … … … … 74
自述(Author)… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … . 107
參考文獻 1. Smith GC, Jackson SP. The DNA-Dependent Protein Kinase. Genes Dev.
13(8):916-934, 1999.
2. Tuteja R, Tuteja N. Ku Autoantigen: A Multifunctional DNA-Binding
Protein. Crit Rev Biochem Mol Biol. 35(1):1-33, 2000.
3. Wang J, Dong X, Reeves WH. A Model for Ku Heterodimer Assembly
and Interaction with DNA. Implications for the Function of Ku Anti-
gen. J Biol Chem. 273(47):31068-31074, 1998.
4. Hammarsten O, Chu G. DNA-Dependent Protein Kinase: DNA Binding
and Activation in the Absence of Ku. Proc Natl Acad Sci U S A. 95(2):
530, 1998.
5. Lim DS, Vogel H, Willerford DM, Sands AT, Platt KA, Hasty P. Analysis
of Ku80-Mutant and Cells with Deficient Levels of p53. Mol Cell Biol.
20(11):3772-3780, 2000.
6. Kim SH, Kim D, Han JS, Jeong CS, Chung BS, Kang CD, Li GC. Ku Au-
toantigen Affects the Susceptibility to Anticancer Drugs. Cancer Re-
search. 59(16):4012-4017, 1999.
70
7. Muller C, Salles B. Regulation of DNA-Dependent Protein Kinase Acti-
vity in Leukemic Cells. Oncogene. 15(19):2343-2348, 1997.
8. Klein A, Miera O, Bauer O, Golfier S, Schriever F. Chemosensitivity of B
Cell Lymphocytic Leukemia and Correlated Expression of Protein
Regu- lating Apoptosis, Cell and DNA Repair. Leukemia. 14(1):40-46,
2000.
9. Casellas R, Nussenzweig A, Wuerffel R, Pelanda R, Reichlin A, Suh H,
Qin XF, Besmer E, Kenter A, Rajewsky K, Nussenzweig MC. Ku80 is Re-
quired for Immunoglobulin Iostype Switching. EMBO J. 17(8):2404-
2411, 1998.
10. Arrington ED, Caldwell MC, Kumaravel TS, Lohani A, Joshi A, Evans
MK, Chen HT, Nussenzweig A, Holbrook NJ, Gorospe M. Enhanced
Sensitivity and Long-Term G2 Arrest in Hydrogen Peroxide-Treated
Ku80-Null Cells Are unrelated to DNA Repair Defects. Free Radic
Biol Med. 29(11):1166-1176, 2000.
11. Manis JP, Gu Y, Lansford R, Sonoda E, Ferrini R, Davidson L,
Rajewsky K, Alt FW. Ku 70 Is Required for Late B Cell Develop-
ment and Immunoglobulin Heavy Chain Class Switching. J Exp
Med. 187(12): 2081-2089, 1998.
12. Kim SH, Um JH, Dong-Won B, Kwon BH, Kim DW, Chung BS, Kang
71
CD. Potentiation of Chemosensitivity in Multidrug-Resistant
Human Leukemia CEM Cells by Inhibition of DNA-Dependent
Protein Kinase Using Wortmannin. Leuk Res. 24(11):917-925, 2000.
13. Sonneveld P. Multidrug Resistant in Haematological Malignancies.
J Intern Med. 247(5):521-534, 2000.
14. Howard MR, Hamilton PJ. Haematology: An Illustrated Colour Text.
287-288, 1997.
15. Motoji T, Motomura S, Wang YH. Multidrug Resistant of Acute
Leukemia and a Strategy to Overcome It. Int J Haematol. 72(4):
418-24, 2000.
16. Han Z, Johnston C, Reeves WH, Carter T, Wyche JH, Hendrickson
EA. Characterization of a Ku86 Variant Protein that Results in
Altered DNA Binding and Diminished DNA-Pependent Protein
Kinase Activity. J Biol Chem. 271(24):14098-14104, 1996.
17. Muller C, Dusseau C, Calsou P, Salles B. Human Normal Peri-
pheral Blood B-Lymphocytes are Deficient in DNA-Dependent
Protein Kinase Activity Due to the Expression of a Variant Form
of the Ku86. Oncogene. 16(12):1553-1560, 1998.
18. Tai YT, Teoh G, Lin B, Davies FE, Chauhan D, Treon SP, Raje N,
72
Hideshima T, Shima Y, Podar K, Anderson KC. Ku86 Variant Expre-
ssion and Function in Multiple Myeloma Cells is Associated with
Increased Sensitivity to DNA Damage. J Immunol. 165(11): 6347-6355,
2000.
19. Sallmyr A, Henriksson G, Fukushima S, Bredberg A. Ku Protein in
Human T and B Lymphocytes: Full Length Functional Form and
Signs of Degradation. Biochim Biophys Acta. 1538:305-312, 2001.
20. Jin S, Kharbanda S, Mayer B, Kufe D, Weaver DT. Binding of Ku
and c-Abl at the Kinase Homology Region of DNA-Dependent
Protein Kinase Catalytic Subunit. J Biol Chem. 272(40):24763-24766,
1997.
21. Rich T, Allen RL, Wyllie AH. Defying Death After DNA Damage.
Nature. 407(6805):777-783, 2000.
22. Deutsch E, Dugray A, AbdulKarim B, Marangoni E, Maggiorella L,
Vaganay S, M'Kacher R, Rasy SD, Eschwege F, Vainchenker W, Turhan
AG, Bourhis J. BCR-ABL Down-Regulates the DNA Repair Protein
DNA-PKcs. Blood. 97(7):2084-2090, 2001.
23. Chan DW, Lees-Miller SP. The DNA-Dependent Protein Kinase is
Inactivated by Autophosphorylation of the Catalytic Subunit. J
Biol Chem. 271(15):8936-8941, 1996.
24. Jeng YW, Chao HC, Chiu CF, Chou WG, Senescent Hman Fibroblasts
have Elevated Ku 86 Proteolytic Cleavage Activity. Mutat Res. 435 (3):
225-232, 1999.
25. Sallmyr A, Du L, Bredberg A, An Inducible Ku86-Degrading Serine
Protease in Human Cells. Biochem Biophys Acta. 1593(1):57-68, 2002.
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  • 同意授權校內瀏覽/列印電子全文服務,於2004-07-30起公開。
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