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系統識別號 U0026-0812200910365050
論文名稱(中文) 新式微型細胞計數器之設計、製作及應用
論文名稱(英文) Design, Fabrication and Characterization of a Novel Micromachined Flow Cytometer
校院名稱 成功大學
系所名稱(中) 工程科學系碩博士班
系所名稱(英) Department of Engineering Science
學年度 91
學期 2
出版年 92
研究生(中文) 回寶珩
研究生(英文) Bao-Herng Hwei
電子信箱 emilyhwei@so-net.net.tw
學號 n9690425
學位類別 碩士
語文別 中文
論文頁數 99頁
口試委員 指導教授-李國賓
口試委員-林哲信
口試委員-陳淑慧
口試委員-曾繁根
口試委員-楊瑞珍
中文關鍵字 微機電系統  生物晶片  微型細胞計數器  介電泳  負介電泳力  微電極陣列  晶片型實驗室 
英文關鍵字 microelectrode  lab-on-a-chip  biochip  micromachined flow cytometers  MEMS  cell manipulation  negative dielectrophoretic force  dielectrophoresis 
學科別分類
中文摘要 本研究提出一新式微型細胞計數器,其可將微粒子或細胞聚焦於三維空間中以利計數和分析。利用整合光纖檢測機構之流體式細胞計數器於快速檢測生物分子中,已成為極重要的分析工具。但是微粒子於第三維z方向上,仍然具有一個自由度,因此微粒子可以在微管道之z方向自由分佈,因而造成該細胞計數器所偵測到之粒子信號強度無法均一。本研究中提出之創新晶片,係藉由兩側邊鞘流控制微粒子或細胞水平方向之聚焦,以及利用整合於晶片上之微電極陣列控制負介電泳力於垂直方向使其聚焦,可以精準地將細胞或微小粒子固定在微管道的中央。此晶片主要包含三個模組,分別為微流體細胞計數器之微管道、控制介電用力之微電極陣列以及光纖檢測機構。經由此新式設計,將不需利用螢光染色來做為微小粒子或細胞不同尺寸辨識,也無須精密的光學校準。此晶片經測試後,由測試結果實現本研究於微粒子或細胞三維聚焦之設計,大幅地改善了偵測效率。此晶片之設計、製作和測試勢必會使得整個醫學診斷工作流程帶來相當大的革新,也可以大幅度的提昇醫療的品質。

在晶片製作部分,本研究利用微細加工方式,在玻璃基材上製作微型流體微粒計數器之微流道,且於其上利用金屬蒸鍍及蝕刻的方式定義出電極陣列,並提出一方便、可靠且符合批次製造的光學偵測系統,利用以蝕刻完成之玻璃基材光纖嵌入晶片中作為光學波導管,簡化了傳統上填充不同折射係數液體作為光學波導管之複雜性。
英文摘要 This study reports a micro flow cytometer with an innovative 3-dimensional focusing function that can concentrate particles or cells at the center of sample stream, resulting in a high-precision cell counting. Focusing of the sample flow is a critical issue for micro flow cytometers while counting the particles or cells using integrated optical detection system such as buried optical waveguides. Appreciable errors could occur if the particles are randomly distributed vertically even though they have been focused horizontally. In this paper, a 3-D focusing micromachined flow cytometer is demonstrated using the combination of dielectrophoretic (DEP) and hydrodynamic forces. Two sheath flows focus the sample flow horizontally by hydrodynamic force and two embedded electrode plates focus the particles vertically utilizing dielectrophoretic force. Three major modules have been integrated on glass substrates to form the microfluidic device, including a hydrodynamically driven flow cytometer, embedded microelectrodes for dielectrophoretic forces and etched optical fibers for on-line cell detection. With this approach, cells with different sizes could be counted without fluorescence labeling and delicate optical alignment procedures are not required. Experimental data show that high-precision particle or cell counting could be achieved. The results of this study will make substantial impacts and contribution to miniaturization of a bio-analytical system.

A fast and reliable processes have been successfully developed in this study to fabricate microfluidic devices and microelectrodes using micro system technologies. The concept of integration of optical sensing mechanism in a microchip has also been realized an implemented. In this effort, it reduced the complexity of stuffing materials for waveguide function.
論文目次 中文摘要........................................................................i
Abstract......................................................................iii
誌謝............................................................................v
目錄..........................................................................vii
表目錄..........................................................................x
圖目錄.........................................................................xi
符號說明......................................................................xix


第一章 緒論
1-1 前言........................................................................1
1-2 微機電系統..................................................................2
1-3 文獻回顧....................................................................4
1-4 研究動機與目的..............................................................7
1-5 研究方法....................................................................9

第二章 理論及數值模擬
2-1 微流體聚焦現象.............................................................12
2-2 介電泳效應.................................................................15
2-2-1 電中性粒子之介電泳效應...................................................16
2-2-2 細胞懸浮液所受之介電泳力.................................................18
2-3 數值模擬...................................................................22
2-3-1 電場模擬.................................................................22
2-3-2 力場模擬.................................................................22
2-3-3 細胞移動軌跡模擬.........................................................23
2-3-4 偶極距於不同頻率之模擬...................................................24

第三章 晶片之設計及製作
3-1 晶片設計...................................................................26
3-2 光罩製作...................................................................27
3-3 晶片製程...................................................................28
3-3-1 微流道之製程.............................................................28
3-3-1-1 晶片清洗...............................................................29
3-3-1-2 微影...................................................................32
3-3-1-3 蝕刻...................................................................34
3-3-2 微電極陣列之製程.........................................................36
3-3-2-1 底材清洗...............................................................36
3-3-2-2 金屬蒸鍍...............................................................36
3-3-2-3 微影及金屬蝕刻.........................................................38
3-3-3 鑽孔.....................................................................40
3-3-4 對位接合.................................................................41
3-4 晶片封裝...................................................................41
3-4-1 光纖嵌入.................................................................42

第四章 結果與討論
4-1 紅血球結構與特性...........................................................44
4-2 實驗架設...................................................................45
4-3 測試結果與討論.............................................................47
4-3-1 負介電泳力之測試與分析...................................................48
4-3-1-1 紅血球於負介電泳力下之測試與分析.......................................48
4-3-2 新式微型細胞計數器之測試.................................................49
4-3-2-1 聚苯乙烯珠之測試與分析.................................................50
4-3-2-2 紅血球於新式微型細胞計數器之應用.......................................51

第五章 結論與未來展望
5-1 結論.......................................................................54
5-2 未來展望...................................................................56

參考文獻.......................................................................92

自述...........................................................................95

著作...........................................................................96



表 目 錄

表2-1..........................................................................31
RCA清潔步驟整理表。
表4-1..........................................................................53
聚苯乙烯珠和紅血球測試定量分析。



圖 目 錄

圖1-1..........................................................................58
傳統的柯爾特粒子計數器(Coulter Particle Counter)裝置示意圖。利用顆粒通過測量小孔產生電阻變化,在轉換為電子訊號。
圖1-2..........................................................................58
(a)螢光標定樣品流之聚焦現象。微管道寬度200μm,樣品流與邊鞘流之流量比為1:10,總進樣流量為0.6 μl/s。(b)實驗裝置示意圖。已聚焦之之細胞,藉由細胞散射出來的光強度變化做為檢測依據。
圖1-3..........................................................................59
(a)細胞計數器裝置示意圖。當細胞樣品流通過雷射光區域時,由光偵測器(Photodetectors)偵測出被細胞散射的光。(b)細胞必須準確地通過雷射光集中區域的正中央,以確保能得到最大的訊號做為分析。
圖1-4..........................................................................59
(a) Miyaky 等人提出之微型流體計數器結構示意圖。(A)為元件樣品進樣和出口槽。(E)為上板使微流道呈密閉型態。(C)唯一讓樣品流注入之微流道,而(B)(D)上、下之邊鞘流分別讓樣品流於z-方向之集中。 (b)微型流體計數器之工作機制。將圖(a)之(A)~(E)接合封裝後為一完整之微型流體計數器。
圖1-5..........................................................................61
(a)G. B. Lee研究團隊提出之二維流式微型細胞計數器示意圖。(b)以折射係數為1.5之玻璃作為晶片基材,因此通道中填入折射係數大於1.5之材料,如:折射係數為1.8之SU-8負型光阻,以形成光纖結構,便能將入射光傳導至樣品流微管道,藉由樣品流中粒子(例如:細胞、血球)對入射光之吸收或散射程度不同,導致出口端光強度改變,並藉由一外接之光偵測器收集出口端之光訊號變化,便可即時偵測細胞之經過並計算其數目。
圖1-6..........................................................................62
(a)利用移動波式介電泳力做驅動之裝置示意圖。樣品流經移動波式介電泳力驅動,其移動方向由左至右,而由整合於晶片上之光纖作為訊號檢測裝置。 (b)利用15 μm之螢光微粒子進行計數所獲得之訊號。由圖可以得知,訊號強度大小不一,乃是由於微粒子並沒有真正集中於樣品流中央。
圖1-7..........................................................................63
利用流體力聚焦(Hydrodynamic Focusing)樣品流,當微粒子通過電極A、B和C時,造成阻抗的變化(ZAC-ZBC),藉以得到微粒子的訊號。
圖1-8..........................................................................63
(a)待測之粒子於中央樣品流中行進,利用兩側流速較快之邊鞘流對中央樣品流進行擠壓,形成流體聚焦效應。聚焦後樣品流中的細胞在流經整合於晶片上之光纖檢測機構時,會對檢測光吸收或散射,而造成檢測光強度之改變,因此可以測知是否有細胞通過。(b)適當地調整邊鞘流與中央樣品流之流速比,可將中央樣品流之寬度縮減至數微米寬,該寬度可小於一個細胞之尺寸,因此被聚焦之樣品流中僅容許一個細胞通過。(c)該設計整合光學檢測機構於該細胞計數器當中,因而不需對待測微粒子進行複雜之螢光標定程序,更可免除傳統細胞計數器龐大複雜之光學元件。但其卻面臨檢測信號強度不夠一致之結果。(d)微粒子於第三維z方向上,仍然具有一個自由度,因此微粒子可以在微管道之z方向自由分佈,因而造成該細胞計數器所偵測到之粒子信號強度無法均一。
圖1-9..........................................................................65
研究方法規劃之魚骨圖。
圖1-10.........................................................................66
本研究之新式微型細胞計數器工作原理示意圖,利用流體力和介電泳力可以使細胞或微粒子集中在微流體管道之正中央。


圖2-1..........................................................................67
微流體細胞計數器各管道間之參數示意圖
圖2-2..........................................................................67
中性粒子於平行電板作用產生電極化。
圖2-3..........................................................................67
電中性粒子於非均勻電場中之介電泳現象。由於球體上方誘發之負電荷群在此電場中受較大之庫倫吸引力,而使粒子最後會吸附於球型電極上。
圖2-4..........................................................................68
當外加電場方向改變時,粒子之誘發偶極距方向會與之前相反,這時可視為粒子上方被誘發之正電荷群受較大庫倫吸引力,所以粒子仍持續往上方移動而吸附於球型電極上。
圖2-5..........................................................................68
當一低極化率的微粒懸浮於一較高極化之溶液,此時介電泳力將被排斥而離開強電場區。
圖2-6..........................................................................69
(a)細胞之極化能力大於溶液,此時細胞被正介電泳力吸引。(b)溶液之極化能力大於細胞,此時細胞被負介電泳力排斥。
圖2-7..........................................................................69
(a)細胞之極化能力大於溶液,所誘導出之電偶極方向恰與電場方向相同,此時細胞膜上電荷的電性與鄰近的電極相異。(b)溶液的極化能力大於細胞,所誘導出之電偶極方向恰與電場方向相反,此時膜上電荷的電性與鄰近的電極相同。
圖2-8..........................................................................69
誘發偶極距與電場之關係。
圖2-9..........................................................................70
細胞在移動波式電場中的受力情形。
圖2-10.........................................................................70
微管道中DEP電極設計之示意圖。
圖2-11.........................................................................70
負介電泳力於x-z平面之電位立體分佈圖[24]。
圖2-12.........................................................................71
負介電泳力在電極上分佈情形。
圖2-13.........................................................................71
由箭號的方向可以看出,微粒子因流體力和介電泳力的疊加作用下,漸漸於微管道中央聚焦。
圖2-14.........................................................................72
以微粒子於微管道z方向距離中央最遠的位置為起始點的細胞,在流體力與負介電泳力作用下的移動軌跡。(A)V=20 Vp-p,(B)V=10 Vp-p。
圖2-15.........................................................................73
聚苯乙烯珠(虛線)和紅血球細胞(實線)偶極距於不同頻率下之變化。
圖3-1..........................................................................74
3-D微型流體微粒計數器之設計圖。
圖3-2..........................................................................74
微流體管道晶片設計尺寸示意圖。
圖3-3..........................................................................75
微電極陣列設計尺寸示意圖。
圖3-4..........................................................................75
光纖偵測區尺寸設計示意圖
圖3-5..........................................................................76
光罩繪製之完成圖。
圖3-6..........................................................................77
晶片製程示意圖。
圖3-7..........................................................................77
蝕刻後之微管道部分。
圖3-8..........................................................................78
晶片清洗裝置圖。
圖3-9..........................................................................78
光阻塗佈機(Spin-Coater)動作示意圖。
圖3-10.........................................................................78
微型細胞計數晶片噴嘴部分之電子顯微鏡影像。
圖3-11.........................................................................79
新式微型細胞計數器之電子顯微鏡影像。
圖3-12.........................................................................79
光纖的切面。
圖3-13.........................................................................79
光線在光纖中被全內反射。
圖3-14.........................................................................80
光纖蝕刻之電子顯微鏡影像。
圖3-15.........................................................................80
新式微型細胞計數晶片完成圖。

圖4-1..........................................................................81
紅血球結構與尺寸圖。
圖4-2..........................................................................81
系統架設方塊圖。
圖4-3..........................................................................82
負介電泳力操控條件之裝置。
圖4-4..........................................................................82
受負介電泳力下排斥之紅血球細胞,於不同頻率下,往點電極反方向移動。
圖4-5..........................................................................84
紅血球細胞負介電泳力定量分析圖。
圖4-6..........................................................................85
利用20μm聚苯乙烯珠進行計數所獲得之訊號。
圖4-7..........................................................................86
利用本研究中之新式微型計數器於20μm聚苯乙烯珠之測試。(A)有負介電泳力作用,(B)無負介電泳力作用。
圖4-8..........................................................................87
利用10μm聚苯乙烯珠進行計數所獲得之訊號。
圖4-9..........................................................................88
利用本研究中之新式微型計數器於10μm聚苯乙烯珠之測試。(A)有負介電泳力作用,(B)無負介電泳力作用。
圖4-10.........................................................................89
利用紅血球細胞進行計數所獲得之訊號。
圖4-11.........................................................................90
利用本研究中之新式微型計數器於紅血球細胞之測試。(A)有負介電泳力作用,(B)無負介電泳力作用。
圖4-12.........................................................................90
測試結果之定量分析。

圖5-1..........................................................................91
樣品流經過新式細胞計數器計數分析後,依大小性質的不同分類,並分別導入預期的樣品收集槽,做更進一步的分析。
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論文全文使用權限
  • 同意授權校內瀏覽/列印電子全文服務,於2003-06-30起公開。
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