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系統識別號 U0026-0307201610502400
論文名稱(中文) 藉由奈米結構化表面引導蛋白質形成規律狀排列
論文名稱(英文) Periodic Protein Assemblies Guided by Functional Nanostructured Surfaces
校院名稱 成功大學
系所名稱(中) 化學系
系所名稱(英) Department of Chemistry
學年度 104
學期 2
出版年 105
研究生(中文) 盧欣妤
研究生(英文) Hsin-Yu Lu
學號 L36034257
學位類別 碩士
語文別 中文
論文頁數 86頁
口試委員 指導教授-李介仁
口試委員-詹揚翔
口試委員-廖尉斯
中文關鍵字 第一型膠原蛋白  自組裝  奈米結構表面  奈米流體  牛血清白蛋白  蛋白質陣列 
英文關鍵字 Collagen type I  self-assembly  nanostructrued srufaces  nanofluid  BSA  protein array 
學科別分類
中文摘要 Part I 中文摘要
第一型膠原蛋白(collagen type I)是細胞外間質(extracellular matrix , ECM)中含量最為豐富的蛋白質,是由三條多胜肽鏈(polypeptide chain)纏繞在一起形成具有三螺旋(triple-helix)結構的纖維(fibril),長度約有300 nm長,直徑約為1.5 nm,各次單元之間具有一暗帶間隙(D-band),約隔67 nm就會出現一次。其功能為提供細胞間生長所需要的支架之用,進而引發一系列的訊息傳遞,故常被用來研究細胞間的相互作用。由於第一型膠原蛋白通常於一般基材表面上會隨機聚集成為纖維絲團塊,甚至形成孔洞凝膠結構,故在生醫材料應用上產生諸多限制,因此本研究的目的在於結合表面化學修飾法及微奈米製程技術,將一般基材表面進行修飾,使之產生具有多種官能基及特定奈米結構的表面,而使膠原蛋白能選擇性地分布於修飾過後的基材表面上,最終形成特定的膠原蛋白微奈米結構。
於本研究中,我們利用有機矽烷自組裝薄膜(organosilane self-assembled monolayers)及多種微奈米製程技術,製作多種奈米結構化的表面,當膠原蛋白分子吸附於此類奈米結構化的表面時,會自發地進行自組裝(self-assemble)過程,形成奈米纖維絲結構,藉由原子力顯微鏡(atomic force microscopy , AFM)的高解析影像分析,我們發現多種截然不同的奈米纖維絲結構,以及膠原蛋白網狀奈米結構生成於奈米結構化的表面上,可直接藉由模板搭配第一型膠原蛋白則可得到由第一型膠原蛋白纖維組成的規律奈米結構。並成功利用所得到的第一型膠原蛋白奈米結構調控細胞,使細胞伸出許多絲狀偽足(filopodia),且會順著底下的膠原蛋白奈米結構生長。此結果證實可利用所得到的各式第一型膠原蛋白奈米結構可調控細胞行為,使細胞產生變化,未來若將此第一型膠原蛋白奈米結構做成多層,形成立體結構,即可更加模擬體內細胞所處環境,以利研究細胞外間質和細胞間的作用。

Part II 中文摘要
Particle lithography先前已被證明為一簡單、便宜、高通量(high throughput)排列蛋白質的方法,但其形成的奈米結構只能侷限於奈米環和奈米洞,並無法隨意調控出所要的奈米結構。由於流體揮發時會牽動其中的物質移動,當流體中溶劑揮發完物質即會沉積於此處,代表可以藉由流體揮發來控制物質的沉積處,因此本研究目的在於是否能利用奈米粒子與基材之間的間隙所造成的奈米流體來控制牛血清白蛋白的排列,以發展簡易方式形成各式不同的蛋白質奈米結構。
從實驗結果中,觀察到的確能藉由溶液蒸發後殘留於奈米球模板內的奈米流體和牛血清白蛋白濃度調控出四種不同的奈米結構─奈米環、奈米環間有奈米線連結、奈米環間有奈米線連接加上奈米點堆積和奈米洞,且這些奈米結構是不容易用其他方法製作出來,因此若能更加了解奈米流體的形成機制,再搭配不同的奈米模版,或許可以製作出更多不同的奈米結構。
英文摘要 Part I 英文摘要
Collagen is a major component of the extracellular matrix (ECM) proteins. Collagen molecules aggregate to form nanofibers with a unique triple helix structure. Collagen nanofibers provide the structural scaffold for cell attachment and further induce a series of signal cascades. Thus, collagen can serve as a model protein to study the matrix-cell interactions. Even though collagen has been used in a wide variety of applications, fibril aggregates and porous gel structures randomly formed on substrates limit the utilization of collagen in biomedical applications. The goal of this research emphasizes using nanotemplates or nanotopography with designed functionalities to regulate self-assembly of collagen nanofibrils on surfaces. Polydimethylsiloxane (PDMS) stamps with nanoline features and monodispersed silica nanoparticles serve as structural templates to guide self-assembly of collagen molecules into arrays of linear and circular collagen nanofibrils, respectively. Morphology and size of circular collagen nanofibrils change with various the protein-to-template ratio and the diameter of silica nanoparticles. In addition, we utilize organosilane self-assembled monolayers (SAMs) and the multi-scale lithographic approaches to produce various nanostructured surfaces with designed functionality and geometry. When collagen molecules adsorb on such nanostructured surfaces, spontaneous self-assembly of collagen guided by nanotopography takes place to form a variety of collagen nanostructures. Our experimental results demonstrate that a series of collagen nanostructures with various size and geometry can be successfully fabricated using nanostructure-guided assembly. We successfully use the collagen nanostructures to control filopodia of NE4C cells growing along collagen nanostructures. These promising discoveries confirm that the variety of collagen nanostructures could be used to induce filopodia formation and cell polarization.

Part II 英文摘要
Particle lithography is an easy method to pattern proteins with nanometer precision and high throughput. However, this method cannot get customized nanostructures. The goal of the research is using nanofluid formed between flat substrate and nanosphere to guide protein and form various ordered and periodic arrays of nanostructures. The results show using spatially-confined nanofluids and different concentrations of BSA can tune four distinct nanostructures: nanoring, nanoline connected with nanoring, nanoline-nanoring network with nanodot between line and ring, and nonapore. If the formation mechanism of nanofluid could be clearly understood, it would lead to fabrication of various periodic nanostructures via spatially-confined nanofluids.
論文目次 目錄
Part I
藉由具功能性的奈米結構化表面去調控膠原蛋白自組裝的過程
Regulation of Collagen Fibrils Self-assembly Process via Nanostructured Surfaces with Various Functionalities
中文摘要 i
英文摘要 ii
誌謝 vi
目錄 vii
圖目錄 xii
壹、 研究之背景 1
一、細胞週邊環境(In vivo environment) 1
二、細胞外間質(Extracellular matrix , ECM) 2
三、膠原蛋白(Collagen) 3
四、第一型膠原蛋白 (Collagen type I , Col I) 4
五、製程(Fabrication) 6
六、原子力顯微鏡(Atomic force microscopy,AFM) 6
貳、 研究之目的 8
參、 材料和方法 9
一、 材料 9
二、 儀器 10
三、 實驗策略 11
四、 實驗方法 12
(1) 配製第一型膠原蛋白溶液及相關溶液 12
(2) 製備基材(substrate) 12
(3) 膠原蛋白自組裝 13
(4) 製備模板 13
(5) 製備矽烷薄膜 14
(6) 氣相沉積法製備具奈米結構的表面 14
(7) Microcontact printing(µCP)製備奈米結構表面 14
(8) 製備具膠原蛋白奈米結構的表面 15
(9) 用於細胞實驗的表面 15
(10)用原子力顯微鏡進行觀察 15
肆、 研究結果與討論 17
一、 第一型膠原蛋白在基材上的表現 17
(1) 所處溶液內的離子種類 17
(2) 所處溶液的pH值 17
(3) 膠原蛋白濃度 18
(4) 膠原蛋白吸附時間 18
(5) 基材 19
二、 製作具奈米結構的表面(實驗策略一) 19
(1) PDMS模板 20
(2) 不同官能基的奈米結構表面 20
三、 第一型膠原蛋白在奈米結構化基材上的表現(實驗策略一) 21
(1) 第一型膠原蛋白在矽烷薄膜(film)上的表現 21
(2) 第一型膠原蛋白在具奈米結構矽晶圓上的表現 22
A.官能基種類 22
B.基材種類 25
C.奈米結構的幾何形狀種類 26
D.膠原蛋白溶液種類 27
四、 利用模版輔助直接製作第一型膠原蛋白奈米結構(實驗策略二) 28
(1) 模板引導自組裝(Template guided self-assembly) 28
(2) 毛細管成形技術(Nanomolding in capillaries) 29
(3) 模板控制乾燥(Lithographically controlled wetting) 30
五、 細胞在第一型膠原蛋白奈米結構上的表現 31
(1) 固定第一型膠原蛋白奈米結構 31
(2) 細胞與線狀第一型膠原蛋白奈米結構的相互作用 32
伍、 結論 34
陸、 參考資料 35
圖附錄 38
Part II
利用局限空間中的奈米流體來使蛋白質自組裝成規律的奈米結構
Protein Self-Assembled into Periodic Nanostructures via Spatially-Confined Nanofluids
中文摘要 xvi
英文摘要 xvii
壹、 研究之背景 66
一、 膠體微影術(Particle lithography) 66
二、 奈米流體(Nanofluid) 66
貳、 研究之目的 68
參、 材料和方法 69
一、 材料 69
二、 儀器 69
三、 實驗方法 69
(1) 製備基材(substrate) 69
(2) 清洗奈米粒子 70
(3) 製備BSA奈米結構表面11、12 70
(4) 用原子力顯微鏡進行觀察 71
肆、 研究結果與討論 72
一、 牛血清白蛋白奈米結構表面 72
二、 調控牛血清白蛋白所形成的奈米結構 73
伍、 結論 76
陸、 參考資料 77
圖附錄 78































圖目錄
Part I
藉由具功能性的奈米結構化表面去調控膠原蛋白自組裝的過程
Regulation of Collagen Fibrils Self-assembly Process via Nanostructured Surfaces with Various Functionalities
圖一、離子種類對第一型膠原蛋白在雲母片上自組裝的影響 38
圖二、溶液pH值對第一型膠原蛋白在雲母片上自組裝的影響 38
圖三、第一型膠原蛋白濃度對其在雲母片上自組裝的影響 39
圖四、第一型膠原蛋白吸附時間對其在雲母片上自組裝的影響 39
圖五、基材對於第一型膠原蛋白自組裝的影響 40
圖六、PDMS模板 40
圖七、蒸氣沉積法在矽晶圓上形成的線形奈米結構 41
圖八、蒸氣沉積法在玻璃上形成的線形奈米結構 42
圖九、OTS薄膜和第一型膠原蛋白在OTS薄膜上的表現 43
圖十、其他矽烷薄膜和第一型膠原蛋白在矽烷薄膜上的表現 44
圖十一、第一型膠原蛋白在具線形奈米結構矽晶圓上的表現 45
圖十二、第一型膠原蛋白在不同官能基線形奈米結構矽晶圓上的表現 46
圖十三、混合OTS和APTMS的矽烷薄膜和第一型膠原蛋白在薄膜上的表現 47
圖十四、混合OTS和APTMS在矽晶圓上形成的線形奈米結構 48
圖十五、第一型膠原蛋白在具線形奈米結構(混合OTS和APTMS形成)的矽晶圓上的表現。 49
圖十六、第一型膠原蛋白在具線形奈米結構玻璃上的表現 50
圖十七、第一型膠原蛋白在不同官能基線形奈米結構矽晶圓和玻璃上的表面覆蓋率 50
圖十八、模板 51
圖十九、矽晶圓上的奈米結構 51
圖二十、第一型膠原蛋白在具奈米結構矽晶圓上的表現 52
圖二十一、第一型膠原蛋白在具線形奈米結構矽晶圓上的表現 53
圖二十二、各式大小的二氧化矽奈米粒子 54
圖二十三、第一型膠原蛋白在雲母片上形成的孔洞結構 54
圖二十四、第一型膠原蛋白在玻璃上形成的孔洞結構 55
圖二十五、第一型膠原蛋白在雲母片上形成的線形結構(未潤洗) 56
圖二十六、第一型膠原蛋白在雲母片上形成的線形結構(未潤洗) 56
圖二十七、第一型膠原蛋白在雲母片上形成的線形結構(潤洗過) 57
圖二十八、PDMS模板 58
圖二十九、第一型膠原蛋白在雲母片上形成的線形結構 58
圖三十、第一型膠原蛋白在玻璃上形成的線形結構(未潤洗) 59
圖三十一、第一型膠原蛋白在雲母片上形成的線形結構 60
圖三十二、第一型膠原蛋白在玻璃上形成的線形結構 60
圖三十三、第一型膠原蛋白在具OTS奈米結構培養皿上的表現 61
圖三十四、第一型膠原蛋白奈米結構經由戊二醛固定在APTMS奈米結構上 62
圖三十五、在液相中觀察經由戊二醛固定在APTMS奈米結構上的第一型膠原蛋白奈米結構 62
圖三十六、液相中觀察NE-4C細胞在一般培養皿上的表現 63
圖三十七、NE-4C細胞在經由戊二醛固定在APTMS薄膜上的第一型膠原蛋白纖維上的表現。 64
圖三十八、液相中觀察NE-4C細胞在經由戊二醛固定在APTMS奈米結構上的第一型膠原蛋白奈米結構上的表現 65
圖三十九、NE-4C細胞在經由戊二醛固定在APTMS奈米結構上的第一型膠原蛋白奈米結構上的表現。 65



Part II
利用局限空間中的奈米流體來使蛋白質自組裝成規律的奈米結構
Protein Self-Assembled into Periodic Nanostructures via Spatially-Confined Nanofluids
圖一、各式大小的聚苯乙烯奈米粒子 79
圖二、牛血清白蛋白在雲母片上形成的環狀結構 79
圖三、牛血清白蛋白在雲母片上形成的孔洞結構 80
圖四、牛血清白蛋白在不同基材上形成的環狀結構(以直徑800 nm聚苯乙烯奈米粒子為模板) 81
圖五、牛血清白蛋白在不同基材上形成的孔洞結構(以直徑800 nm聚苯乙烯奈米粒子為模板) 81
圖六、分析聚苯乙烯奈米粒子粒徑對牛血清白蛋白環狀奈米結構的影響 82
圖七、分析聚苯乙烯奈米粒子粒徑對牛血清白蛋白孔洞奈米結構的影響 83
圖八、以蒸發後殘留於奈米球模板內的水分和牛血清白蛋白濃度調控出的各式牛血清白蛋白奈米結構(以直徑800 nm聚苯乙烯奈米粒子為模板) 84
圖九、以蒸發後殘留於奈米球模板內的水分和牛血清白蛋白濃度調控出的各式牛血清白蛋白奈米結構(以直徑500 nm聚苯乙烯奈米粒子為模板) 85
圖十、以蒸發後殘留於奈米球模板內的水分和牛血清白蛋白濃度(2 mg/ml)調控出的牛血清白蛋白奈米結構 86
圖十一、排列不均勻的奈米粒子陣列導致形成牛血清白蛋白奈米環間有線連接的結構 86
圖十二、以蒸發後殘留於奈米球模板內的水分和牛血清白蛋白濃度調控出的各式牛血清白蛋白奈米結構的表面覆蓋率 87

參考文獻 Part I
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